核仁磷酸蛋白基因NPM1敲除人宮頸癌細(xì)胞株的構(gòu)建及功能
關(guān)鍵詞：核仁磷酸蛋白1 人類宮頸癌細(xì)胞 基因敲除 細(xì)胞增殖
摘要：目的通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向敲除人類宮頸癌細(xì)胞(HELA)的核仁磷酸蛋白1基因(nucleophosmin1,NPM1),探討敲除對(duì)HELA細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法利用crispr.mit.edusgRNA在線設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)sgRNA,通過(guò)T7E1系統(tǒng)篩選合適的sgRNA,將設(shè)計(jì)好的質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)入HELA細(xì)胞株,通過(guò)博來(lái)霉素(zeocin)抗生素進(jìn)行篩選,通過(guò)Westernblot,PCR,基因測(cè)序等手段確認(rèn)敲除細(xì)胞系的建立,通過(guò)免疫熒光的方式觀察敲除細(xì)胞株。結(jié)果T7E1酶切PCR退火產(chǎn)物之后瓊脂糖凝膠結(jié)果表明,CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)HELA細(xì)胞基因組進(jìn)行了切割,并在同源重組時(shí)發(fā)生了堿基錯(cuò)配;Westernblot結(jié)果說(shuō)明基因敲除后NPM1蛋白表達(dá)消失;基因測(cè)序的結(jié)果表明敲除細(xì)胞系建立的成功;免疫熒光的結(jié)果表明該細(xì)胞系出現(xiàn)異常核仁現(xiàn)象。結(jié)論NPM1敲除后細(xì)胞核仁異常,可能影響細(xì)胞正常生命進(jìn)程。
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