草魚肝細(xì)胞外泌體的分離鑒定及其對(duì)肝細(xì)胞miR-122/33和免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響
關(guān)鍵詞：草魚 肝細(xì)胞 外泌體 分離 鑒定
摘要：外泌體是具有磷脂雙分子膜結(jié)構(gòu)的納米級(jí)囊泡,能夠參與機(jī)體多種生理過程。實(shí)驗(yàn)探討了草魚肝細(xì)胞外泌體的分離鑒定方法,并初步研究外泌體對(duì)草魚肝細(xì)胞中miRNAs及免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)以草魚肝細(xì)胞L8824為材料,通過超速離心獲得外泌體,利用電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài),采用納米顆粒示蹤分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技術(shù)檢測(cè)外泌體粒徑和數(shù)量,同時(shí)利用Western blot分析其標(biāo)志蛋白CD63的表達(dá),最后用正常肝細(xì)胞和油酸誘導(dǎo)的脂肪肝細(xì)胞源外泌體孵育草魚肝細(xì)胞,通過Real-time qPCR技術(shù)檢測(cè)兩種不同來源的外泌體對(duì)草魚肝細(xì)胞中miR-122/33及免疫相關(guān)基因(TNF-α,NF-κB,IL-1β,IL-6和IL-10)轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示,草魚肝細(xì)胞外泌體為30~150 nm的不均勻囊泡,呈圓形或橢圓形,有完整的膜結(jié)構(gòu);外泌體標(biāo)志蛋白CD63呈陽性表達(dá);NTA技術(shù)檢測(cè)顯示外泌體囊泡占所有囊泡的50%以上;脂肪肝細(xì)胞源外泌體顯著提高了肝細(xì)胞中miR-122及炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。研究表明,通過超速離心法可成功分離草魚肝細(xì)胞外泌體,且脂肪肝細(xì)胞源外泌體在草魚肝細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮重要作用。
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