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利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建Tiki1基因修飾豬模型
關鍵詞：tiki1 基因打靶 豬模型
摘要：Tiki1基因是哈佛大學兒童醫(yī)學院賀熹教授實驗室發(fā)現的一個對蛙頭部的誘導起到決定性作用的新基因,但Tiki1基因在小鼠等嚙齒類動物中缺失,因此無法利用小鼠等小動物來研究其在哺乳動物中的作用.本文利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)結合體細胞克隆技術構建Tiki1基因修飾豬模型,研究Tiki1基因在豬發(fā)育中的作用.我們利用賀熹教授團隊提供的人Tiki1基因序列,在豬的基因組數據庫中比對出與其同源性最高的一段序列設計2個靶位點(g1和g2).以設計的靶位點構建打靶質粒轉染豬胎兒成纖維細胞,經細胞篩選、PCR擴增及測序共鑒定了52個單細胞克隆株.最終選擇靶位點g1為純合雙敲的5個單細胞克隆株和靶位點g2為純合雙敲的3個單細胞克隆株作為構建Tiki1基因敲除豬的核供體.我們共計構建了720個重組胚胎,分別植入3頭代孕母豬,其中有1頭經B超檢測成功懷孕并妊娠到期產下13頭發(fā)育正常的克隆豬,經測序鑒定其中12頭為Tiki1基因雙敲除豬模型,Tiki1基因敲除克隆豬健康存活至今.結果表明Tiki1基因對于豬早期發(fā)育的作用機理不同于蛙,其在豬早期發(fā)育的過程中的具體作用機理有待后續(xù)進一步的深入研究.
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