利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建Tiki1基因修飾豬模型
關(guān)鍵詞：tiki1 基因打靶 豬模型
摘要：Tiki1基因是哈佛大學(xué)兒童醫(yī)學(xué)院賀熹教授實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的一個(gè)對(duì)蛙頭部的誘導(dǎo)起到?jīng)Q定性作用的新基因,但Tiki1基因在小鼠等嚙齒類(lèi)動(dòng)物中缺失,因此無(wú)法利用小鼠等小動(dòng)物來(lái)研究其在哺乳動(dòng)物中的作用.本文利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合體細(xì)胞克隆技術(shù)構(gòu)建Tiki1基因修飾豬模型,研究Tiki1基因在豬發(fā)育中的作用.我們利用賀熹教授團(tuán)隊(duì)提供的人Tiki1基因序列,在豬的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)出與其同源性最高的一段序列設(shè)計(jì)2個(gè)靶位點(diǎn)(g1和g2).以設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)構(gòu)建打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞篩選、PCR擴(kuò)增及測(cè)序共鑒定了52個(gè)單細(xì)胞克隆株.最終選擇靶位點(diǎn)g1為純合雙敲的5個(gè)單細(xì)胞克隆株和靶位點(diǎn)g2為純合雙敲的3個(gè)單細(xì)胞克隆株作為構(gòu)建Tiki1基因敲除豬的核供體.我們共計(jì)構(gòu)建了720個(gè)重組胚胎,分別植入3頭代孕母豬,其中有1頭經(jīng)B超檢測(cè)成功懷孕并妊娠到期產(chǎn)下13頭發(fā)育正常的克隆豬,經(jīng)測(cè)序鑒定其中12頭為T(mén)iki1基因雙敲除豬模型,Tiki1基因敲除克隆豬健康存活至今.結(jié)果表明Tiki1基因?qū)τ谪i早期發(fā)育的作用機(jī)理不同于蛙,其在豬早期發(fā)育的過(guò)程中的具體作用機(jī)理有待后續(xù)進(jìn)一步的深入研究.
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