山葡萄C4H基因的克隆表達(dá)及遺傳轉(zhuǎn)化分析
關(guān)鍵詞：山葡萄 克隆 c4h基因 原核表達(dá) 遺傳轉(zhuǎn)化
摘要：通過生物學(xué)技術(shù)來(lái)研究C4H基因在山葡萄著色過程中的作用,進(jìn)而揭示山葡萄果皮著色的分子機(jī)理;利用RT-PCR技術(shù)克隆了山葡萄C4H基因的全長(zhǎng)cDNA序列,并對(duì)該蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)其功能;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)C4H基因在山葡萄8個(gè)不同轉(zhuǎn)色時(shí)期的表達(dá)量,將克隆獲得的山葡萄C4H基因完整的ORF連接到原核表達(dá)載體pET28a上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliBL21(DE3),并通過不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物.為了驗(yàn)證山葡萄C4H基因的功能,構(gòu)建了表達(dá)載體pCC4H并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101.用菌液浸泡花序法對(duì)擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,在含50mg/LKan的培養(yǎng)基上對(duì)T0代種子進(jìn)行篩選.克隆獲得的山葡萄C4HcDNA全長(zhǎng)1735bp,開放閱讀框1518bp,編碼505個(gè)氨基酸,該基因表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量為57.70KDa,等電點(diǎn)值9.06.C4H基因在山葡萄果皮轉(zhuǎn)色各個(gè)時(shí)期均存在表達(dá);該基因原核表達(dá)產(chǎn)物與預(yù)期大小一致,表明原核表達(dá)成功,擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化先后得到3個(gè)陽(yáng)性幼苗.對(duì)移栽成活的2株抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)為陽(yáng)性,2株葉片顏色均變成紫紅色;經(jīng)花色素苷質(zhì)量濃度的測(cè)定表明其質(zhì)量濃度比對(duì)照組植株高出3倍.在擬南芥中花色素苷質(zhì)量濃度雖然較低,但還是能少量合成,說(shuō)明其花色素苷生物合成途徑是開通的,只是積累的量較少.
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