癌相關成纖維細胞來源的外泌體在促骨肉瘤侵襲轉移中作用的實驗研究
關鍵詞：骨肉瘤 外泌體 癌相關成纖維細胞 肺轉移 腫瘤微環(huán)境
摘要：目的探討癌相關成纖維細胞(CAFs)來源的外泌體對骨肉瘤侵襲及轉移的影響。方法利用人源骨肉瘤細胞株Saos-2采用差速貼壁法分離、培養(yǎng)CAFs,顯微鏡下觀察CAFs的形態(tài),免疫組織化學觀察α-SMA蛋白表達對CAFs進行鑒定。培養(yǎng)CAFs,采用ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒分離外泌體。通過透射電鏡觀察外泌體形態(tài),Western blot檢測外泌體特異性標記蛋白β-actin、CD63表達情況對外泌體進行鑒定。培養(yǎng)人源骨肉瘤細胞株Saos-2,分為外泌體組和對照組,采用細胞劃痕及Transwell小室實驗觀察外泌體對Saos-2細胞遷移和侵襲能力的影響。選取一級5周齡BALB/c-nu雌性裸鼠12只,按編號隨機分為外泌體組和對照組,每組6只。兩組均采用皮下移植成瘤法在裸鼠右側背部皮下接種人骨肉瘤Saos-2細胞與Matrigel基質膠混合懸液,建立裸鼠骨肉瘤腫瘤模型。造模結束后即刻進行尾靜脈注射:外泌體組每只裸鼠通過尾靜脈注射濃度為0.1μg/μL的外泌體懸液30μL,對照組裸鼠尾靜脈注射等量生理鹽水,兩組均1次/周,共注射6次。第1次注射后每日觀察裸鼠成瘤情況,從裸鼠右側背部皮下可觸及腫塊開始,測量兩組裸鼠腫塊的最長徑和最長徑的最大垂直短徑,計算腫瘤體積,此后每周測量1次,共測量6次。完成最后一次測量后腹腔麻醉斷椎法處死裸鼠,完整取出腫塊并稱重。取裸鼠肺組織進行切片HE染色觀察兩組裸鼠肺轉移情況。結果顯微鏡下觀察CAFs呈長梭形,排列雜亂,無方向性;細胞免疫組織化學染色結果顯示:CAFs的α-SMA蛋白表達陽性,提示CAFs提取成功。電鏡觀察外泌體呈70~100 nm圓形或橢圓形膜性囊泡狀結構;Western blot結果顯示外泌體中CD63蛋白呈高表達,β-actin蛋白表達較弱,提示成功分離CAFs來源外泌體。細胞劃痕實驗、侵襲實驗結果顯示:外泌體組細胞遷移距離、遷移率、侵襲細胞數(shù)目分別為(0.19±0.02)mm、0.81%±0.11%?
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