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篇1

[關(guān)鍵詞] 小柴胡顆粒；高效液相色譜法；指紋圖譜；質(zhì)量評(píng)價(jià)

小柴胡顆粒是根據(jù)東漢張仲景《傷寒論》中的小柴胡湯方加工制成的現(xiàn)代中成藥，是中醫(yī)和解劑的代表方，由柴胡、黃芩、黨參、甘草、姜半夏、大棗和生姜7味藥組成，具有解表散熱、疏肝和胃的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，該方還具有較好的抗炎、保肝利膽、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等作用，在臨床上應(yīng)用廣泛[2-3]。小柴胡顆粒生產(chǎn)廠家眾多，質(zhì)量參差不齊，僅針對(duì)某個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行定性、定量分析并不能對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效地控制，而特征指紋圖譜能較全面直觀地表征出中藥復(fù)方制劑中所含化學(xué)成分的種類(lèi)和數(shù)量，進(jìn)而反映該制劑內(nèi)在的質(zhì)量[4]。因此本研究建立了市售小柴胡顆粒的HPLC指紋圖譜研究方法，對(duì)小柴胡顆粒中7 種主要指標(biāo)性成分進(jìn)行同時(shí)分析測(cè)定，并用相似度評(píng)價(jià)軟件和SPSS軟件，對(duì)其指紋圖譜的特征峰數(shù)據(jù)進(jìn)行了相似度計(jì)算和系統(tǒng)聚類(lèi)分析，評(píng)價(jià)了不同廠家和同廠家不同批次市售小柴胡顆粒的質(zhì)量，旨在為小柴胡顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一種較為全面的分析手段。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；G1311C 1260Quat四元泵（美國(guó)安捷倫）；G1329B 1260ALS進(jìn)樣器（美國(guó)安捷倫）；G1314B 1260VWD VL檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫）；Rev.B.04.03[52]液相色譜工作站（美國(guó)安捷倫）；BT 125D天平（賽多利斯）；KH5200E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

本試驗(yàn)收集了11個(gè)不同廠家市售小柴胡顆粒，購(gòu)自全國(guó)各地零售藥店。樣品來(lái)源和批號(hào)見(jiàn)表1，2。將11個(gè)廠家樣品隨機(jī)編號(hào)，依次記為S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9，S10，S11。

黃芩苷（baicalin，批號(hào)110715-201117）、黃芩素（baicalein，批號(hào)111595-201105）、漢黃芩素（wogonin，批號(hào)111514-201016）、甘草苷（liquiritin，批號(hào)111610-201106）、甘草酸銨（ammonium glycyrrhizinate，批號(hào)110731-201116）、柴胡皂苷A（saikosaponin A，批號(hào)110777-201108）對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；漢黃芩苷（wogonoside，批號(hào)111014）對(duì)照品購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純（美國(guó)Fisher），磷酸為分析純（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表3，流速0.8 mL·min1；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。所有組分于120 min內(nèi)被檢測(cè)完。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別取甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、柴胡皂苷A和漢黃芩素對(duì)照品適量精密稱定，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.015 3，0.507，0.104，0.021 5，0.050 6，0.011 8，0.011 5 g·L-1的混合對(duì)照溶液，過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液作為混合對(duì)照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取同一廠家同一批次小柴胡顆粒適量，研成細(xì)粉，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取S1廠家小柴胡顆粒樣品1份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別準(zhǔn)確吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄指紋圖譜，以黃芩苷色譜峰（指紋圖譜中14號(hào)峰）為內(nèi)參比峰，計(jì)算指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值，結(jié)果表明所有共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1廠家小柴胡顆粒樣品1份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0，3，12，24，48 h，按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄指紋圖譜，以黃芩苷色譜峰（指紋圖譜中14號(hào)峰）為內(nèi)參比峰，計(jì)算指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明所有共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1廠家小柴胡顆粒樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，各吸取10 μL，按2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄指紋圖譜，以黃芩苷色譜峰（指紋圖譜中14號(hào)峰）為內(nèi)參比峰，計(jì)算指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明所有共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明重復(fù)性良好。

2.5 小柴胡顆粒指紋圖譜的測(cè)定及技術(shù)參數(shù)

2.5.1 不同廠家小柴胡顆粒的指紋圖譜測(cè)定及共有峰標(biāo)定 取上述11個(gè)廠家小柴胡顆粒樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別準(zhǔn)確吸取混合對(duì)照品溶液及11個(gè)小柴胡顆粒樣品的供試品溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄指紋圖譜。

將圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)軟件分析，以S2廠家小柴胡顆粒圖譜為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行多點(diǎn)校正，匹配色譜峰，以中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

經(jīng)與對(duì)照品鑒定，21.065，49.573，90.143，98.369，102.766，104.913，110.005 min出峰分別為甘草苷（8號(hào)峰）、黃芩苷（14號(hào)峰）、漢黃芩苷（19號(hào)峰）、黃芩素（22號(hào)峰）、甘草酸銨（25號(hào)峰）、柴胡皂苷A（26號(hào)峰）、漢黃芩素（27號(hào)峰）。其中，黃芩苷（14號(hào)峰）分離度較好，峰面積較大且穩(wěn)定，故選其為參照峰（S）。以黃芩苷為參照峰的HPLC指紋圖譜確定共有峰29個(gè)，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積值，結(jié)果表明，11批不同生產(chǎn)廠家小柴胡顆粒相對(duì)保留時(shí)間的RSD較?。?～0.78%），而相對(duì)峰面積的RSD較大，說(shuō)明小柴胡顆粒指紋圖譜中主要峰群的直觀特征基本一致，但各成分含量有較大的區(qū)別。

2.5.2 同廠家不同批次小柴胡顆粒的指紋圖譜測(cè)定 取上述S3和S11廠家各5個(gè)批次小柴胡顆粒樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄指紋圖譜，見(jiàn)圖4，5。

2.5.3 相似度評(píng)價(jià) 采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）》評(píng)價(jià)2個(gè)廠家不同批次小柴胡顆粒的指紋圖譜，分別以S2，批號(hào)111249，110903圖譜為參照譜，以中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，計(jì)算樣品與共有模式之間的相似度，評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量，見(jiàn)表4，5。

2.5.4 樣品色譜數(shù)據(jù)的系統(tǒng)聚類(lèi)分析 運(yùn)用SPSS軟件，對(duì)所得高效液相指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析。采用組件均連法（average linkage between groups），利用夾角余弦（cosine）作為樣品的測(cè)度，聚類(lèi)分析將不同廠家樣品分為3類(lèi)。其中廠家S3，S4，S11分在第I類(lèi)，廠家S1，S2，S5，S6，S7，S8，S9分在第II類(lèi)，S10分在第III類(lèi)，見(jiàn)圖6。由結(jié)果可知，不同廠家的小柴胡顆粒樣品存在不同程度的質(zhì)量差異。

3 討論

由于黨參、姜半夏、大棗和生姜4味藥材在該提取方法和色譜檢測(cè)條件下很難被檢測(cè)出來(lái)，所以在小柴胡顆粒指紋圖譜上沒(méi)有體現(xiàn)這幾個(gè)藥材的相關(guān)信息。

不同廠家和同一廠家不同批次的小柴胡顆粒樣品指紋圖譜相似度均大于0.9，表明各樣品相似度較好。不同廠家樣品之間相對(duì)含量RSD有差異，甚至某些組分差異較大，可能是由于不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)工藝參數(shù)、生產(chǎn)設(shè)備性能、對(duì)中藥材有效成分提取率的差異，造成了產(chǎn)品成分含量的差別，但各廠家樣品的指紋圖譜整體面貌相似，所建立的指紋圖譜相對(duì)保留時(shí)間重復(fù)性良好，相似度較高，可以作為鑒別小柴胡顆粒質(zhì)量的指標(biāo)之一。

聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，不同廠家被聚為3類(lèi)，說(shuō)明廠家間質(zhì)量有所差異，原因可能是相似度的計(jì)算是按各色譜峰的峰面積中位數(shù)生成共有模式，其分析的是每張指紋圖譜的各個(gè)色譜峰；而聚類(lèi)分析的計(jì)算是利用組件均連法，采用夾角余弦測(cè)定的，其分析的是各個(gè)指紋圖譜的共有峰，所以2種分析結(jié)果有所區(qū)別，但相似度結(jié)果中S10樣品相似度相對(duì)較低，在聚類(lèi)分析結(jié)果中被單獨(dú)聚為第III類(lèi)，說(shuō)明2種分析結(jié)果大體相一致。

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Study on fingerprint of Xiaochaihu granules sold in the market

YAN Lei， LIN Long-fei， ZHANG Hui， DANG Xiao-fang， NI Jian*

（School of Chinese Material Medica， Beijing University of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100102， China）